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海南華泰來水產科技有限公司

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種蝦基地:海南省文昌市翁田鎮下山村/大昆村

育苗基地:海南省文昌市翁田鎮/會文鎮煙墩椰林區

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蝦苗廠藻類三級培養技術,看看育苗得下多少工夫

編輯:華泰來水產    發布時間:2016-11-06    瀏覽:818次

對蝦種苗企業的生存主要是依靠蝦苗養殖效果來決定的,蝦苗成活率的高低直接影響著產業鏈的上上下下。單胞藻對于蝦苗早期是最適合的餌料,如果培育得當,不僅可以節約成本,減少育苗水體環境負荷,尤其是對于蝦苗的發育打下堅實的基礎,提高成活率。結合個人的育苗感受,投喂單胞藻與不投喂的區別還是有的,比如苗的變態時間縮短,活力個頭大小,水質均優于未投喂單胞藻的苗,當然如果培育不得當,反作用也有,比如投喂有害菌超標的藻液,藻類老化,投喂過量等。所以合理運用,方可收到理想效果。限于個人水平,描述方法的錯誤不足之處,懇請大家指正。

一 、單胞藻純培養室操作描述

儀器使用

(1) 超凈工作臺

使用前提前開機,打開紫外線燈和風機開關20分鐘。超凈臺面上不存放不必要的物品,保持工作區內的凈化氣流不受干擾,工作時盡量避免作明顯干擾氣流的動作;超凈臺保持光滑水平,光滑便于用酒精消毒布擦,水平是倒培養基時使培養皿內平板厚度一致。工作時超凈臺周圍空氣流動要緩慢,雜菌盡量減少,所以要定期清潔消毒保種室內,關閉門窗,盡可能減少雜菌數量;空氣過濾網定期清潔。

(2)真空泵和溶劑過濾器及過濾膜

此環節過濾只是為單胞藻純培養室(保種,提純,擴培試管級)準備清潔無菌海水。其他級別的培養無需此環節。

過濾膜使用0.2微米孔徑,不可用手拿,用鑷子選取。真空泵與溶劑過濾器之間通過合適口徑的橡膠管連接緊密,每次過濾要注意濾膜的過濾效果,防止濾孔阻塞影響過濾效果。濾瓶內的濾液不能沒過濾板出水口,否則濾液將被抽吸入真空泵,導致真空泵損壞。

應該使濾板內的營養液過濾盡后(無水滴)才能停泵。要定期注意真空泵內油量,注意加油。

(3) 恒溫鼓風干燥箱

設定溫度時。先按控溫儀功能鍵SET進入溫度設定狀態,此時SP設定顯示一閃一閃,要按移動位鍵配合加鍵或減鍵,設定時先從分位數字設定,一直到百位數,設定結束需按一下功能鍵SET,此時干燥箱進入升溫狀態,加熱指示燈亮,當箱內溫度接近設定溫度時,加熱指示燈閃動多次,控制進入恒溫狀態。

使用注意事項:物品不能堆得太滿,更不能堵住出風口,以免影響溫度均勻上升。若是有牛皮紙和保鮮膜時,溫度不能超過180度。取出物品時,箱內外溫差不宜過高,防止玻璃器皿炸裂。橡膠制品不能放入。

(4)加濕器

配合生化培養箱使用。

水源是蒸餾水;不應容器內帶水移動加濕器;加水時應在容器上表示的滿水線為止。

應注意的事項:平時留意觀察水箱的存水量,及時予以補充,遠離熱源,腐蝕物。

(5)蒸汽消毒器

容器加水時,水位一定要超過電熱管,最好是到3個支撐點的下緣,如果連續使用,應在每次消毒前補足蒸發水量,不然少水會燒壞電熱管。蓋上的放氣軟管插入消毒桶圓槽內,對正蓋和主體的螺栓槽,依次將相對方的翼型螺母予以旋緊,使蓋與主體密合,加熱開始時,應將放氣閥與安全閥的小手柄扳至垂直放氣方位,必須待有較急蒸汽噴出,即將小手柄扳回水平“關閉”方位。

當到達所需壓力和溫度,計算消毒時間,消毒畢后,關閉電源,待壓力指針指向0時,將放氣閥的小手柄扳至垂直放氣方位,氣放完后,打開容器蓋。物品消毒后要迅速干燥。

應注意滅菌液體時,不超過盛液體容器體積的3/4,瓶塞不可用軟木塞或未打孔的橡膠塞。滅菌器內冷空氣必須完全排除。因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓,當水蒸氣含冷空氣時,壓力表所表示的壓力是水蒸氣壓力和部分冷空氣壓力之和,不是水蒸氣的實際壓力,而同一壓力下的實際溫度,含空氣的蒸汽低于飽和蒸汽,這樣導致達不了消毒效果。絕不可堵塞安全閥出氣孔,必須留空位保證其暢通放氣,發現超溫超壓,立即斷電。

蒸餾器

先關閉放水閥,打開進水閥,待溢水皮管有水流出,方可接通電源,此時可暫時關閉進水閥,待出水皮管有蒸餾水流出,打開進水閥,制備蒸餾水。定期清洗蒸餾器內壁,除去水垢,不然影響蒸餾水質量和使用效果。切不可關閉水閥制備蒸餾水,否則燒壞電熱管。

(6)鼓風機

定期更換吸氣口的過濾棉,異常情況,請電工檢查。

(7)空調

保種室若有生長藻種,需維持恒定溫度,反之關閉。一級,二級空調視外界氣溫調整開關。

二 、衛生消毒

工具衛生消毒

1、濾水筒式過濾器。筒式過濾器的濾芯應用一次更換一次,用過的濾芯浸泡在1%鹽酸溶液中消毒12h以上。然后用洗潔精清洗,再用足量清水沖洗干凈,晾干備用。(濾芯規格應小于等于0.5微米)。

2、試管(規格10毫升到20毫升),錐形瓶(50毫升到200毫升),500ml錐形瓶,2.5L瓶廣口瓶,移液管,移液槍管/盒,玻璃氣管,膠氣管,氣石,溶劑過濾器,培養皿。用過后應當用清水清洗后浸泡于1% 鹽酸12h以上(溶劑過濾器除外,浸泡時相近大小器皿分類放不同的消毒桶,規格相差大,易導致相互碰撞碎爛)然后用洗潔精清洗(用毛刷清洗試管底部時,不可太用力,否則底部易破裂),再用大量清水沖洗干凈,風干或曬干,高壓滅菌后,放入恒溫干燥箱(膠氣管,氣石除外)干燥備用。

3、聚乙烯藻袋用于二級藻類藻種掛袋培養或3級擴培(一般使用盛裝藻液12升左右)。先用清水沖洗干凈內外,浸泡于1% 鹽酸12h以上,再用大量清水沖洗干凈,風干或曬干,備用。由于藻袋近似密封性,對于防止微生物污染有很好的效果。

4、毛巾、保種室,一級和二級毛巾不可混用,所用毛巾后都應消毒清洗晾干后備用。

5、錫箔紙:除非粘上油污或污物以及破損,都應重復使用。

6、牛皮紙:定期拿到烘箱烘干。

7、定期更換空氣過濾器(用于1,2級培養的進氣過濾)的濾芯,濾芯已油化或沖散的棄去。

8、定期更換鼓風機進風口的過濾棉。

9、對新購入的器皿應先除去包裝沾染的污垢后,用洗潔精刷洗,流水沖凈,再浸泡于1%的鹽酸12h,使游離的堿性物質除去,再用清水沖洗干凈,風干或曬干備用。

室內衛生消毒

1、保種室每天早上用清水擦洗實驗臺面,地板,墻壁,木架后,開紫外燈消毒20分鐘,此時關掉空調,關掉日光燈,由于紫外燈照射會產生一定量的臭氧,對人體有害,所以消毒關閉紫外燈后人應隔一段時間再進去。進保種室換鞋。

2、一級和二級室每天清潔,接種前接種后承載物框架都應用消毒液消毒。

3、門口消毒池定期更換消毒藥水(高錳酸鉀)。

4、常用消毒劑濃度 1%鹽酸,次氯酸鈉20ppm(有效氯),碘液(1000ppm),酒精70-75%,高錳酸鉀1mg/L。

三 、接種

藻種固體培養基制備

所需燒杯,玻棒須清洗干凈,錐形瓶和培養皿須消毒清洗滅菌烘干。將稱好的純化瓊脂粉加入燒杯再加入一定量的海水,加熱(必須不停攪拌,以免瓊脂糊底燒焦)至完全融化,加熱后的瓊脂培養基應當透明無顯著沉淀,若明顯,可采用清潔的白色薄絨布或中間夾有薄層吸水棉的雙層紗布鋪在漏斗上趁熱過濾,融化畢后精確加入營養鹽(維生素B溶液須等培養基高壓滅菌后冷卻至50攝氏度以下再加)。

培養基采用121攝氏度高壓蒸汽滅菌20至30分鐘即可,培養基滅菌后應立即取出,冷卻至50攝氏度以下,即加維生素B溶液。將盛裝培養基的錐形瓶和培養皿放在超凈工作臺上,點燃酒精燈,右手托起錐形瓶底,將瓶口在酒精燈稍加燒,然后迅速將培養基倒入培養皿中,以鋪滿皿底為止(厚薄適中)。鋪放好后,放置20-30分鐘,待培養基凝固后,即開始操作。

若是做斜面培養基,則加入維生素B溶液后,將盛裝培養基的錐形瓶和試管以及一根厚約1厘米的小木板放在超凈工作臺上。分裝約為試管高度的1/3-2/3(視情況操作),分裝量應以能形成2/3底層和1/3斜面量為好,擺置成適當斜面,待其自然凝固。培養基制備好后,如發現破裂,水分浸入,色澤異常等均應棄去.

待凝固后即進行操作,現一般采用平板劃線接種和涂布接種。

平板劃線接種

接種環在酒精燈火焰上充分燒紅后,接種柄一邊轉動一邊慢慢來回通過火焰3次,待冷卻至室溫方可挑取藻種(為保證藻種不被燙死,挑種前可將接種環接觸培養皿內壁或培養基),迅速接種至新培養基(劃線可采用斜線法,方格法,曲線法,放射法等)。左手握住平板,用大拇指和食指稍稍抬起皿蓋,同時靠近火焰周圍,右手持接種環伸入皿內,在平板上一個區域作劃線(依方法不同,動作不同)。劃線時使接種環與平板表面成30-40度角輕輕接觸,以腕力在表面作較快的滑動(注意不要劃破平板表面或伸進培養基內)。接種環挑種后和劃線完抽出時均不可碰及皿壁/口,更不能碰其它物體和臺面。接種完后,將接種環從柄部至環端逐漸通過酒精燈火焰滅菌,不能直接燒環,以免殘留在接種環上的藻體或菌體爆濺污染空間。上述操作完成后,即用無菌封口膜封培養皿口(膜使用前須用酒精消毒,紫外燈消毒,風干),封口時,用左手大拇指摁住膜一邊末端,右手大拇指和食指捏住另一邊末端,迅速繞培養皿口繞一圈,封口。

涂布接種

所用種液必須經過弧菌檢測合格后方可使用。涂布棒在火焰上慢慢來回過火焰3次,冷卻(不可驟冷),將種液用移液槍從試管吸出注入平板上面(槍管不可碰及試管外壁,更不能碰及其它物品或臺面),迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布,讓藻液分布均勻,畢后,封口同平板劃線。

試管液體培養基接種

所用種液必須經過弧菌檢測合格后方可使用。火焰滅菌前試管口外壁不能有水滴(易導致受熱不均而破裂),燒試管口時,試管傾斜45度角,不斷移動試管,使試管口受熱均勻,滅菌時間3秒左右。滅菌后不能驟冷,防止試管破裂。畢后,用盛裝營養液150或200ml的錐形瓶(也要滅菌瓶口)向試管中傾倒營養液,每次只能拿一個試管(注:若幾個試管對比時,可以同時拿在手里,用大拇指和手掌),倒好后,同樣試管和錐形瓶口滅菌,試管塞也要滅菌,塞試管塞時不要移動試管迎接塞,以免試管在移動中納入可能含菌空氣,火焰旁為無菌。

所有試管分裝好后,即接種。用移液槍選取移液量(試管口滅菌),注入新培養基,槍管不可碰及管外壁,更不能碰及其它物品或臺面,一支槍管只能和同一種液使用,選取另一試管種液時必須更換槍頭。接種畢后,選取合適光照溫度培養。由于試管培養是靜置培養,而在靜置條件下,藻細胞會聚集在試管底部,且藻細胞周圍會形成透過養分的屏障,營養鹽的攝入受阻,光照吸收不均,為使營養鹽攝入正常,藻細胞受光均勻,需要定時搖置試管(手先噴消毒酒精,手腕使勁搖,不要擺臂,不能倒置搖)

三角瓶,500ml瓶,2.5L瓶液體培養基接種

三角瓶接種需無菌操作。500ml瓶,2.5L瓶液體培養基接種均在室內衛生條件下操作。3種瓶和所需營養液及錫紙,移液管,洗耳球,氣管,氣石均需經消毒清洗,滅菌后使用。三角瓶需定時搖置,500ml,2.5L瓶培養在通氣條件下培養。

二級聚乙烯藻袋液體培養基接種

氣管,氣石均需經消毒清洗,滅菌后使用,抽藻管前次用畢后應當用水泵將管內灌滿消毒鹽酸溶液,今次用前需用海水或淡水沖洗干凈后使用。選取的種液應當是無明顯沉淀,泡沫,原生動物,附著物,色澤正常,藻細胞密度大,形態正常,弧菌檢測合格后選用。所用海水漂白水消毒有效氯應足10ppm,曝氣12小時,檢測余氯,加硫代硫酸鈉中和,方可使用。若使用稀釋的漂白水,應當天配制當天使用,而未使用的要在24小時后棄去。且稀釋的漂白水必須加蓋放在避光的容器內保存。由于漂白水會隨時間漸漸分解,一次性購入的漂白水不應太多,不要過量儲存,以免影響滅菌功效。

1,2,3級接藻示意

試管→三角瓶→500ml瓶子→2500ml瓶子→20升的藻種聚乙烯袋 →18升的擴培藻聚乙烯袋或者培藻池

相關說明

1、母液的配置可以參考教科書上所寫,然后結合當地的水質適當修改即可。氮,磷,鐵元素,維生素B1,B12是必須使用,維生素母液保存于低溫弱光環境下,其中維生素的添加需要先高壓滅菌后再加入母液中。其余營養鹽先配置好后,再滅菌。如果是硅藻類,還應加上硅酸鈉。

2、保種室所需營養液(母液千分之0.8的比例添加)除需高壓滅菌外還必須經過真空泵抽濾后才能用,微孔濾膜直徑為50毫米,孔徑為0.2微米。

3、接種比例A:試管0.07—0.09(隨密度大小變化),10毫升試管加營養液7毫升,藻種0.5毫升,20毫升試管中營養液加12.5毫升營養液,1毫升藻種。B:三角瓶0.09-0.11。在100毫升,150毫升,200毫升,250毫升三角瓶中分別加營養液,70,80,120,150毫升(可按一試管對應一個三角瓶加入),C: 500毫升瓶(400毫升營養液)(按1個三角瓶對應1個500毫升瓶加入)D:2.5升瓶(2升營養液)(按1個500毫升瓶對應1個2.5升瓶加入),注意:上述若發現藻生長情況不好,需要先鏡檢,判斷后再決定是否接種。

一般情況下3袋二級藻種應先擴培接種于容量400升的桶(海水貯備及營養液提前配置好),然后立即進行二級藻袋擴種,每個聚乙烯袋加18升左右藻水。

4、保種培養基制備:按1.5%的比例加瓊脂粉,煮沸后加營養鹽(母液千分之1添加),高壓滅菌。維生素需高壓滅菌后培養基冷卻至30攝氏度方可加入。(可用劃線法,涂布法等分離培養藻種)。

5、儀器的清洗維護。溶劑過濾器使用后只用洗潔精和清水清洗。高壓滅菌后備用。其它玻璃儀器,氣管,氣石,移液槍筒使用后需要浸泡在百分之一到百分之十的稀鹽酸溶液中至少半天,才能拿出清洗,風干,高壓滅菌后備用。

說明:10的2次方標示成10^2,以下數字的次方通用此表示法

三級藻生產

三級藻系統包括用水處理以及配送,溫度與光照控制,藻種的供應等。為確保擴大培養成功,從接種到收獲的培養時間應該盡量縮短,以避免因為開放式培養隨培養規模擴大接觸外界感染源時間加長,三級藻池滋生過多的有害生物,使三級培養失敗。

1—1高水位低密度接種(接種密度為P×10^4cell/ml,P為接種密度萬位數值)(未特別說明藻水藻細胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三級藻第二次加水和收獲的密度為105級)

若一天三級濃縮藻需求量為A升,則總藻細胞數目為K=A×10^3×(B×10^7)cell(K為A升濃縮藻所含的藻細胞數值,B為濃縮藻密度千萬位的數值),一般情況下二級藻種的密度為C×10^6cell/ml(C為二級藻密度百萬位的數值),若第一天接種E噸藻水,則一天需要二級藻種體積d=E×10^6×P×104/C×10^6=EP×10/C升,第三天加水F噸,此時加水后藻水密度E×10^6×Y×10^5/(E+F)×10^6cell/ml(Y為第三天加F噸水之前藻水密度十萬位數值),然后第五天收獲時,藻池藻水藻細胞總數目應為H=(E+F)×10^5×Z×10^6(Z為藻池藻水密度十萬位數,H為藻池藻水藻細胞總數目),因為總需求量的藻細胞數目應等于最后藻池藻水藻細胞總數目,則K=H,則A×10^3×B×10^7=(E+F)×10^6×Z×10^5經過計算是A×B=(E+F)×10×Z。

舉例

若一天需濃縮藻320升,則A=320,(一般情況下E和F的值接近),則因為K=H,所以320×B=20EZ,即320B=20EZ,E=16B/Z,即B/Z噸藻池藻水可以收集濃縮藻20升(B為濃縮藻密度千萬位的數值,Z為藻池藻水密度十萬位數),即若一天需要濃縮藻A升,則每天應接種E=AB÷20Z噸水。(Z和B的值應經過三級培養和收集藻水后才知道近似數值)。

1—2高水位低密度接種(接種密度為P×10^4cell/ml,P為接種密度萬位數值)(未特別說明的藻水藻細胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三級藻第二次加水和收獲密度為10^6級)。

若一天三級濃縮藻需求量為A升,則總藻細胞數目為K=A×10^3×(B×10^7)cell (K為A升濃縮藻所含的藻細胞數值,B為濃縮藻密度千萬位的數值),一般情況下二級藻種的密度為C×10^6cell/ml(C為二級藻密度百萬位的數值),若一天接種E噸藻水,則一天需要二級藻種體積d=E×10^6×P×10^4/C×10^6=EP×10/C升,第三天加水F噸,此時加水后藻水密度E×10^6×Y×10^6/(E+F) ×10^6 cell/ml(Y為第三天加F噸水之前藻水密度百萬位數值),然后第五天收獲時,藻池藻水藻細胞總數目應為H=(E+F)×10^6×Z×10^6 (Z為藻池藻水密度百萬位數,H為藻池藻水藻細胞總數目),因為總需求量的藻細胞數目應等于最后藻池藻水藻細胞總數目,則K=H,則 A×10^3×B×10^7 =(E+F)×10^6×Z×10^6經過計算是A×B=(E+F) ×100×Z, (一般情況下E和F的值接近),則近似AB=200EZ, 即若一天需要濃縮藻A升,則每天應接種E=AB÷200Z噸水。(Z和B的值應經過三級培養和收集藻水后才知道近似數值)。

2—1低水位高密度接種(接種密度為P×10^5cell/ml,P為接種密度十萬位數值)(未特別說明藻水藻細胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三級藻第二次,第三次加水和收獲的密度為105級)。

若一天三級濃縮藻需求量為A升,則總藻細胞數目為K=A×10^3×(B×10^7)cell (K為A升濃縮藻所含的藻細胞數值,B為濃縮藻密度千萬位的數值),一般情況下二級藻種的密度為C×10^6cell/ml(C為二級藻密度百萬位的數值),若第一天接種E噸藻水,則一天需要二級藻種體積d=E×10^6×P×10^5/C×10^6=EP×100/C升,第二天加水F噸,此時加水后藻水密度E×10^6×Y×10^5/(E+F)×10^6cell/ml(Y為第二天加F噸水之前藻水密度十萬位數值),然后第三天加水G噸時,藻池藻水藻細胞密度應為J=(E+F)×10^6×Z×10^5/(E+F+G)×10^6(Z為藻池藻水密度十萬位數),第四天或第五天收獲時,藻池藻水藻細胞總數目應為H=(E+F+G)×10^6×W×10^5(W為藻池藻水密度十萬位數,H為藻池藻水藻細胞總數目),因為總需求量的藻細胞數目應等于最后藻池藻水藻細胞總數目。

則K=H,則A×10^3×B×10^7=(E+F+G)×10^6×W×10^5經過計算是A×B=(E+F+G) ×10×W,

(一般情況下E,F,G的值接近),則近似AB=30EW, 即若一天需要濃縮藻A升,則每天應接種E=AB÷30W噸水。(W和B的值應經過三級培養和收集藻水后才知道近似數值)。

2—2低水位高密度接種(接種密度為P×10^5cell/ml,P為接種密度十萬位數值)(未特別說明藻水藻細胞密度就是cell/ml)(以下的推理是建立在三級藻第二次,第三次加水和收獲的密度為10^6級)。

若一天三級濃縮藻需求量為A升,則總藻細胞數目為K=A×10^3×(B×10^7)cell (K為A升濃縮藻所含的藻細胞數值,B為濃縮藻密度千萬位的數值),一般情況下二級藻種的密度為C×10^6cell/ml(C為二級藻密度百萬位的數值),若一天接種E噸藻水,則一天需要二級藻種體積d=E×10^6×P×10^5/C×10^6=EP×100/C升,第二天加水F噸,此時加水后藻水密度E×10^6×Y×10^6/(E+F)×10^6cell/ml(Y為第二天加F噸水之前藻水密度百萬位數值),然后第三天加水G噸時,藻池藻水藻細胞密度應為J=(E+F)×10^6×Z×10^6/(E+F+G) ×10^6 (Z為藻池藻水密度百萬位數),第四天或第五天收獲時,藻池藻水藻細胞總數目應為H=(E+F+G)×10^6×W×10^6 (W為藻池藻水密度百萬位數,H為藻池藻水藻細胞總數目),因為總需求量的藻細胞數目應等于最后藻池藻水藻細胞總數目,則K=H,則A×10^3×B×10^7=(E+F+G)×10^6×W×10^6經過計算是A×B=(E+F+G) ×10×W。(一般情況下E,F,G的值接近),則近似AB=300EW, 即若一天需要濃縮藻A升,則每天應接種E=AB÷300W噸水。(W和B的值應經過實地三級培養和收集藻水后才知道近似數值)。

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